Micro Coupes à l'aide de Polyéthylène Glycol (PEG)




Pour effectuer une préparation de lames à fin d’examen microscopique, il est le plus souvent procédé par écrasement ou par percussion, éventuellement avec une dilacération préalable.
Mais ces méthodes qui permettent d’examiner facilement et rapidement les spores, et quelquefois certaines cystides, a cependant le gros inconvénient de casser les éléments, d’éjecter les spores des stérigmates et de modifier fortement leur disposition.
C’est pourquoi il est toujours préférable d’effectuer une coupe. Mais le problème reste que cette opération demeure un exercice difficile parce que la coupe doit être la plus mince possible.
Si la coupe « à la volée », avec une lame souple de rasoir, est une technique facile à mettre en œuvre, ses résultats sont très aléatoires. La simple torsion de la lame souple modifie l’épaisseur de la coupe de plusieurs dixièmes de mm. Quant à la coupe guidée « contre l’ongle », elle nous a donné des résultats certes quelquefois presque convenables, mais rarement, il faut l’admettre.

Nous avons testé successivement plusieurs dispositifs d’aide à la coupe microscopique, dits « microtomes » :
Dans un premier temps nous avons utilisé un microtome de type « Ranvier » qui est le plus simple, mais qui ne fut pas vraiment satisfaisant.
Nous avons alors construit un microtome « à rampe » (figure droite ci-dessous).
Comme pour le microtome de Ranvier, l’échantillon est coincé dans un bloc de mousse de sureau, mais malgré un réglage plus facile, la coupe restait difficilement régulière, car le matériau, trop mou, glissait sous la lame.





Nous avons alors cherché une méthode permettant, sans le dégrader, de rendre le matériel plus ferme à la coupe.
  1. La paraffine
    On fait dessécher l’échantillon que l’on fige ensuite dans un bloc de paraffine fondue. On effectue la coupe dans le bloc, puis on dégage le copeau dans un bain de xylène. Inconvénients : préparation longue et détérioration de l’échantillon par le dessèchement et le xylène. Nous avons donc écarté cette technique.

  2. L’alcool polyvinylique (PVA)
    Cette fois, l ’échantillon est incorporé au PVA à l’état humide, et le copeau dégagé à l’eau. On évite alors la plupart des inconvénients de la méthode à la paraffine. Une fois sec, l’échantillon est enrobé d’une mince couche de PVA qui lui donne une meilleure rigidité pour la coupe. Reste que cette méthode demande un délai de séchage d’au moins 24 heures, donc inutilisable en extemporané.

  3. Le Polyéthylène Glycol (PEG)
    Le PEG (Polyéthylène Glycol) 4000 se présente sous forme de petits copeaux, de consistance rappelant la paraffine. Nous avons choisi le PEG 4000 qui se solidifie à 53-56 °C.

Matériel nécessaire (ou très recommandé) Méthode proposée Lorsque la coupe a été effectuée :
Caractéristiques générales du PEG :

Fusion au dessus de 53-56 °C.
Retrait à la solidification : environ 7 % du volume.
Toxicité : aucune. Ce produit est utilisé pour la fabrication de suppositoires, pommades, etc...
Conservation : à l'abri de l'humidité.
Avantages du PEG : préparation très rapide (par rapport au PVA, par exemple, qui demande plus de 24 h de séchage)
Inconvénient : la plaque chauffante est nécessaire pour faire du bon travail
Conservation des coupes : aucun essai effectué à l'heure actuelle avec le PEG. Noter que des solutions ont été testées avec l'alcool polyvinylique lactophénolé (PVALPh) (1)


Remarques :

Le matériel

La chaufferette

Le PEG

Le microtome

Le microtome de « Ranvier » est un tube muni d’une collerette et d’un piston à vis (figure gauche ci-dessus). Le matériel est coincé dans un bloc de mousse de sureau et est poussé vers l’extérieur par le piston. Si, par exemple, le pas de vis est de 1 mm, 1/10éme de tour fait avancer, en théorie, le bloc de 0,100 mm. Si son usage est une avancée certaine par rapport à la coupe « à la volée », nous ne l’avons pas trouvé assez satisfaisant.
Le microtome « à rampe » : deux rampes inclinées sont superposées tête-bêche. Lorsque l’on écarte les deux plans inclinés, la hauteur diminue. On obtient facilement des incréments de l’ordre de 1/100 ème de mm (notre microtome a un rapport 130/1, c’est à dire que pour un tour complet de la molette, la platine baisse de 130 microns).
Le microtome à piston a l'avantage de la simplicité et de la légèreté. Le microtome à rampe permet des incréments plus précis et donc de meilleurs résultats. En fait, le microtome de Ranvier a été conçu pour être utilisé avec de la moelle de sureau. Le faible diamètre de la moelle de sureau ne lui donne pas assez de résistance à la flexion, et elle a tendance à se coucher lors de la coupe, d’autant plus que sa consistance n’est pas toujours constante. Nous pensons qu’un microtome de type « Ranvier amélioré » devrait, à coût raisonnable, donner de meilleurs résultats : on garderait la technique du piston et de la vis au pas de 1 mm, mais on augmenterait le diamètre du piston à 15 ou 20 mm, ce qui donnera plus de rigidité à la mousse synthétique.
Prix :
Microtome de Ranvier : de 20 à 150,00 Euro
Microtome à rampe professionnel : au moins 2.000,00 Euro


La mousse



Le rasoir



Divers

Nous avons obtenu une coupe réussie sur Tremella mesenterica (à l’état frais !) pourtant très élastique.
La vue droite ci-dessous montre une fraction de la coupe d’une lame d’un petit exemplaire d’Agrocybe pediades (objectif x40 , Canon G2 , mise au point manuelle, 1/10 sec, f 1 : 2.2 ).
Lorsque le matériel est très clair, il est difficile, sans binoculaire, de distinguer le fragment de matériel de la mousse. On peut alors déposer le colorant sur le matériel avant de l’enrober de PEG, ce qui se fait sans difficulté, puisque les colorants sont pratiquement tous solubles dans l’eau.


Bibliographie :

(1) (1) : Fiche technique du PVA par Marcel LECOMTE
(voir http://users.skynet.be/Champignons_passion ou mlecomte@skynet.be)
(2): Introduction à l’étude microscopique des champignons par Z.de Izzarra, S.M. du Poitou
(3) Les deux microtomes photographiés sont de fabrication personnelle


Annexe :

Préparation par dissociation et écrasement
Rappelons cette technique simple et rapide, conseillée aux débutants, pour la plupart des espèces courantes (c’est à dire suffisamment fragile pour être écrasées sans difficulté) :
Pour écraser, on peut :
Il est généralement préférable de faire la première observation sans colorant ni réactif. Si l’on désire rajouter du colorant sur la même préparation, poser une goutte de colorant sur le bord du couvre lame, tapoter pour aider l’absorption par capillarité, et récupérer l’excédent de colorant par l’autre côté de la lamelle avec un morceau de papier buvard.
Pour être utilisable, l’épaisseur de la préparation ne doit pas dépasser celle de une ou deux spores, c’est à dire quelques dizaines de microns (à l’œil, elle doit être presque transparente, puisque le microscope est utilisé par transmission).